بررسی ایمنی زایی ژنهای L7L12 و P39 در موشهای Balac در word

برای دریافت پروژه اینجا کلیک کنید

 بررسی ایمنی زایی ژنهای L7L12 و P39 در موشهای Balac در word دارای 65 صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است

فایل ورد بررسی ایمنی زایی ژنهای L7L12 و P39 در موشهای Balac در word  کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه  و مراکز دولتی می باشد.

این پروژه توسط مرکز مرکز پروژه های دانشجویی ارائه میگردد

توجه : در صورت  مشاهده  بهم ريختگي احتمالي در متون زير ،دليل ان کپي کردن اين مطالب از داخل فایل ورد مي باشد و در فايل اصلي بررسی ایمنی زایی ژنهای L7L12 و P39 در موشهای Balac در word،به هيچ وجه بهم ريختگي وجود ندارد


بخشی از متن بررسی ایمنی زایی ژنهای L7L12 و P39 در موشهای Balac در word :

فصل دوم

هدف از این تحقیق بررسی ایمنی زایی ژنهای L7/L12 و P39 در موشهای Balac است. بنابراین پس از جداسازی و تكثیر ژنهای فوق مراحل زیر در این تحقیق انجام گرفت.

1- لكون نمودن ژنهای فوق در یك ناقل انتقال دهنده Cleaning vector

2- تعیین ترادف نوكلئوتیدی ژنهای جداشده و مقایسه آن با ژنهای L7/L12

3- كلون نمودن ژنها در پلاسمید بیان كننده پروكاریونی Procaryotic expression vector

4- تولید و تخلیص پروتئینهای L7/L12 و P39

5- كلون نمودن آنها در پلاسمید بیان كننده اوكاریوتی Eucaryotic expression vector

6- هاری كردن پلاسمیدهای فوق از آندوتوكسین

7- تزریق پلاسمیدها، بسویه واكنش و سویه بیماریزا بروسلاآبورتوس به موش Balb/C

8- سنجشهای ایمونولوژیك

باكتریها و پلاسمیدهایی كه برای انجام این پایان نامه استفاده دشه اند بترتیب زیر می باشند:

باكتریها: بروسلاآبورتوس سویه های 19S و 544 اشدیشیالكی سویه

اشریشیالكی سویه BL21 – اشریشیاكی سویه BL21(DE3(Plyss

پلاسمیرها: PGEX4T1 – PRT 28a – SK+(pSK) – Pblue Script-PCDNA3

– جداسازی كروموزوم بروسلا آبورتوس 19S:

برای تكثیر ج داسازی ژنهای L7/L12 و P39 ابتدا كروموزوم باكتری جداسازی گردید.

مواد:

بافر TE:

Tris – Hel 10mm

EDTA 1.0mm

‍PH بافر را پس از تهیه برروی 8 تنظیم می نمائیم.

پروتئیناز K:

CTAB/NaCl:

Nacl 4.1gr

CTAB 10gr

DDW 100ml (Final Volume)

روش:

ابتدا محیط برنسط برات را تهیه و استریل نموده و ml5 از محیط را با بروسط آبورتوس سویه 19S تلقیح می نمائیم. پس 48 تا 72 ساعت باكتریها رشد كرده و كدورت مناسبی را پیدا می كند. بقیه مراحل تخلیص كروموزوم بشرح زیر است:

1- 5/1 میلی لیتر از سوسپاستیون فوق را مدت 2 دقیقه در rpm5000 سانتریفوژ می نمائیم. محلول رویی را دور می ریزیم.

2- Ml576 از بافر TE را بر روی رسوب باكتری اضافه كرده و رسوب را در بافر حل می نمائیم. سپس ml30 از SDS(10%) و ml3 از پروئیناز K (mg/ml20) را افزوده و بمدت یكساعت در دمای 0C37 نگهداری می نمائیم.

3- پس از مخلوز Ml100 از (M5)NaCl از محلول CTAB/NaCl بمیزان Ml80 اضافه كرده و بمدت 10 دققیق در 0C65 انكوبه می كنیم.

4- هم حجم مخلوط بالا از تركیب كلروفرم – ایزوآمیل (1/24) به مخلوط افزوده و سپس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در rpm10000 سانترفوژ می كنیم. محلول رویی را به لوله دیگر منتقل می نمائیم.

5- هم حجم محلول روئی ترمیب فنل – كلروفرم – ایزوآمیل (1/24/25) پس از مخلوط بمدت 5 دقیقه در vpr10000 سانتریفوژ كرده و محلول رویی به لوله دیگری منتقل می نمائیم.

6- هم حجم محلول روئی ایزوپروپانل اضافه نموده و مخلوط می كنیم. پس از چند دقیقه DNA كروموزومی ته نشین شده كه می توان بات یك پیپت پاستور آنرا جمع آوری نمائیم.

7- رسوب DNA كروموزومی را با الكل 70% شستشو داده و پس از خشك شدن در مجاورت هوا در Ml100 از بافر TE حل می نمائیم.

بررسی كمی و كیفی DNA كروموزومی:

برای تعیین خلوط كروموزوم باكتری از مواد و وسایل زیر استفاده میشود.

1- بافر PBE pH=8(10X)

Tris – base 890mM

Boric Acid 890mM

EDTA 25mM

2- آگارز MP

3- تانك الكتروفورز افقی

روش:

ابتدا آگارز MP در بافر TBE(0.5x) را بكمك حرارت حل كرده و ژل آگارز افقی را سینی مخصوص تانك الكتروفورز افقی تهیه می نمائیم. سپس به مقدار Ml5 از DNA كروموزومی را در چلهك ژل ساخته شده ریخته و در تانك الكتروفورز حاوی بافر TBE(0.5x) پس از برقراری جریان الكتریكی مستقیم الكتروفورز می كنیم.

بریا تعیین مقدار DNA نیز پس از تهیه رقت تز كروموزوم DD آنرا در (Optimal Density) طول موج 260 نانومتر اندازه گیری می نمائیم. مقدار DNA بر اساس فرمول:عكس رقت 50 DD قرائت شده = مقدار DNA تعیین می گردد.

– مرحله پس از جداسازی كروموزوم تكثیر و جداسازی ژنهای مورد نظر است. این فرآیند با استفاده از دستگاه PCR انجام می گردد. در دستگاه PCR با استفاده از عوامل پایه ای، ژن مورد نظر را می توان با استفاده از آنزیم تك پلی مرآز Tag Polymerase تكثیر نمود. عوامل پایه ای ذكر شده شامل موارد ذیل است.

1- قالب

2- پرایمر جلو Forward

3- پرایمر عقب Revers

4- دروكسی نوكلئوتیدها LNTP

5- منیزیوم

6- بافر

7- آنزیم پلی مرآز

8- آب مقطر استریل

برای تهیه پرایمرها ابتدا باید آنها را طراحی كرد. برای طراحی پرایمرهای ژن L7/L12 و P39 ابتدا مترادف نوكلئوتیدی ژنهای فوق را از مركز اطلاعاتی NCBI بدست می آوریم.

accession No(L7/L12). L27819

accession No(P39). L35038

سپس بر این اساس و درنظر گرفتن نكات استاندارد طراحی پرایمر از جمله طول پرایمر، دمای اتصال G+C%، تولید پرایمر، تولید لوپ یا حلقه و … ترادف پرایمرهای تعیین میگردد. در این مرحله از آنالیزهای كامپیوتری توسط برنامه Dlogo و Blast استفاده میگردد.

ترادف ژن مورد نظر و پرایمرهای Forward و Reverse برای جداسازی ژنهای فوق از باكتری بروسلا به شرح زیر است:

1- پرایمرهای L7/L12

Forward:

5’ GGA AAT GCT GAT CTC GCA AA3’

Revers:

5’ CCA CTT GAG TTC AAC XTT GGC CA3’

2- پرایمرهای P39

Forward:

5’ GCC GGC GCC TGT TGC CAA 3’

Reverse:

5’ C CGC TTT TGC GGC TTC AA 3’

جهت سهولت مراحل كلونینگ و با توجه به محلهای ممكن برای كلون سازی در پلاسمیدهای حد واسط و پلاسمیدهای بیانی دو جایگاه آنزیمی BamHI و XhoI درابتدا و انتهای پرایمر طراحی شده است. پرایمرهای طراحی شده توسط شركت MWG آلمان ساخته شد.

برای انجام PCR از دستگاه TECHNE(Cambridge) مدل BENIUS استفاده شده است. برای بهینه سازی تكثیر ژنهای ذكر شده غلظتهای مختلف یون منیزیم (از 5/1 تا 5/3 میلی مولار) و دماهای مختلف مناسب برای اتصال پرایمرها با DNA كروموزومی (66-63 درجه سانتیگراد) بكار رفته است.

– تائید ژنوم سنتز شده توسط PCR:

برای تایید صحت قطعه ژنوم بدست آمده از PCR از هضم آنزیمی ژنهای فوق استفاده می گردد. چنانچه از هضم آنزیمی ژن L7/L12 با آنزیمهای EC0RI و Hind III بترتیب قطعات (168+206) و (305+69) باید دیده شود و از هضم آنزیمی ژن P39 با آنزیمهای NEOL و Hind III بترتیب قطعات (136+560+709) و (553+652) باید دیده شود.

برای تایید نهایی صحت ژنهای تكثیر شده از نظر ماهیت و ترادف نوكلئوتیدی آنها، این ژنها ابتدا در ناقل pSK+ كلون گردید و سپس برای تعیین سكانس به شركت مربوط ارسال گردید.

– كلونینگ ژنهای L7/L12 و P39 در كلونینگ pSK+:

برای كلونینگ ژنهای فوق ابتدا باید ژنها تحت اثر آنزیمهای BamHI و xhoI قرارگرفته، سپس ناقل پلاسمیدی pSK نیز با آنزیمهای اخیر برش داده شود.

1- برش آنزیمی ژنهای L7/L12 و P39 با آنزیمهای BamHI و xhoI.

2- برش آنزیمی پلاسمید pSK با آنزیمهای BamHI و xhoI پلاسمید pSK در حدود kb96/2 وزن دارد. این پلاسمید دارای یك ناحیه تكثیری ColE1، یك ناحیه مقاومت به آمپی سیلین تحریك ناحیه f1 origin و یك ناحیه بنام multiple cloning site=MCS كه جایگاه تعدادی از آنزیمهای تحدیدی را در خود دارد. برای تكثیز پلاسمید فوق از باكتری اشدیشیاكلی استفاده می گردد.

3- برای برش آنزیمی این پلاسمید ابتدا باكتری حاوی این پلاسمید را تكثیر میدهد. در ضمن تكثیر باكتری پلاسمید مورد نظر در باكتری همانندسازی كرده و تعداد آن افزایش می یابد. برای تكثیر باكتری از كشت آن در ml2 محیط LB حاوی ng/ml50 آنتی بیوتیك آمپی سیلین استفاده می شود. پس از 18 ساعت كشت مورد نظر كدورت مناسب را پیدا میكند. پس از آن پلاسمید از باكتری تخلیص میگردد.

مواد:

1- SET buffer:

Sucrose 50mM

EDTA 10mM

Tris-Hcl pH 8 15mM

2- بافر لیزكننده:

Lysis Buffer (1ml)

Na OH (2N) 100ml

SDS (10%) 100ml

DDW 800ml

3- استات پتاسیم 5 مولار با pH 4.2

Potassiun Acetate 5M for 100ml

KAC (4M) 60ml

Acetic Acid 11.5ml

DDW 28.5ml

روش:

ابتدا 5/1 میلی لیتر از كشت 18 ساعت باكتری را با استفاده از سانتریفوژ با دور rpm4000 بمدت 5 دقیقه رسوب میدهیم. سپس رسوب بدست آمده را در 100ml از SET buffer كاملاً حل كرده بمدت 5 دقیقه در حرارت اتاق قرار می دهیم. پس از مدت فوق ml200 از محلول لیز بافر تازه تهیه شده را در رسوب سوسپانسیون فوق ریخته، بخوبی مخلوط كرده و بمدت 2 دقیقه در یخ قرار میدهیم. سپی ml150 از محلول KAC بر نخلوط فوق ریخته پس از مخلوط نمودن مجدداً بمدت 5 دقیقه در یخ میگذاریم.

جهت تفكیك پروتئینهای آزادشده سلولی از DNA پلاسمید ml450 از تركیب فنل-كلروفرم – ایزوآمیل الكل (1/24/25) بر سوسپانسیون حاوی باكتریهای لیز شده افزوده و بمدت 5 دقیقه با دور rpm10000 سناتریفوژ می نمائیم. محلول رویی را در لوله دیگر ریخته و به آن یك میلی لیتر اتانل مطلق سرد می افزرائیم. سپس با استفاده از سانتریفوژ با دور rpm1000 بمدت 5 دقیقه DNA پلاسمیدی را رسوب میدهیم. DNA رسوب داده را با الكل 70% شستشو میدهیم. پس از خشك شدن رسوب در مجاورت هوا، در ml20 از بافر TE حل نموده و به آن ئم5 از آنزیم Rnase A(5mg/ml) برای حذف RNA موجود اضافه می كنیم و بمدت نیم ساعت در 0c37 قرار میدهیم. برای نگهداری پلاسمید از 0c20- استفاده میشود.

پس از تلخیص، پلاسمید از نظر كیفی و كمی سنجیده میشود. برای این منظور از روشی كه قبلاً در مورد كروموزوم باكتری توضیح داده شد، استفاده میگردد.

– هضم آنزمی پلاسمید sPK:

پس از تعیین غلظت پلاسمیدهای خالص شده هضم آنزیمی آن با استفاده از آنزیمهای BamHI و xhoI صورت میگیرد.

pSK 5ml(10ng)

BamHI 1ml

xhoI 1ml

Baffer (y Lango) 2ml

DDW 21ml

Tota l 30ml

پس از مدت 2 ساعت انكوباسیون در دمای 0c37 برای اطمینان از غلظت و كیفیت نمونه هضم شده آنرا برروی ژل آگارز 8/0% بررسی می نمائیم.

– هضم آنزیمی ژنهای L7/L12 و P39:

ژنهای فوق را نیز نظیر پلامید pSK تحت اثر آنزیمهای BamHI و xhoI قرار می دهیم.

L7/L12 10ml P39 10ml

BamHI 1ml BamHI 1ml

xhoI 1ml xhoI 1ml

Baffer 2ml Baffer 2ml

DDW 21 DDW 21

total 30 total 30

– اتصال ژنهای L7/L12 و P39 با پلاسمید (Ligation preparation) PSK برای اتصال قطعات ژنی با پلاسمید PSK از آنزیم T4 DNA Ligale استفاده می شود.

L7/L12 10ml P39 10ml

PSK 2ml PSK 2ml

T4 DNA ligale 1ml T4DNA ligale 1ml

Baffer 1.5ml Baffer 1.5ml

DDW 0.5ml DDW 0.5ml

total 15ml total 15ml

مخلوط فوق را بمدت 16 ساعت در 0c14 قرار میدهیم.

– انتقال DNA نوتركیب به میزبان) E0ch (HHI

– برای انتقال DNA نوتركیب به سلولهای میزبان ) E0ch (HHI ابتدا باید سلولهای میزبانهای مورد نظر و آماده پذیرش DNA نوتكریب بنمائیم. Competent cell برای تهیه این سلولها از وش زیر استفاده می گردد.

مواد:

محیط SOB

SOB for 100ml

0.5% yeast extract

2% trypton

10mm Nacl

2.5mm Kcl

10mm Mgcl2

10mm MgSo4

پس از تنظیم pH برروی 7-7.2 تنظیم كرده و پس از آن اتوكلاو می كنیم.

بافر TFBI

TFBI (for 100ml)

KAC 30mm

MnCl2.4H2O 50mm

Kcl 100mm

Cacl2.2H2O 10mm

Glycerol 15ml

H2O Complete to 100ml

PH را برروی 8/5 تنظیم كرده و پس از آن با اتوكلاو استریل می نمائیم.

بافر TFBII

TFB II (for 100ml)

MOPS 10mm

Cacl2.2H2O 75mm

KCL 10mm

Glycerol 15ml

H2O Complete to 100ml

پس از مخلوط نمودن آنرا با اتوكلاو استریل می كنیم.

روش تهیه Competent Cell

100 میلی لیتر از محیط SOB را در یك ارلن یك لیتری تهیه كرده و اتوكلاو می نمائیم. به محیط فوق 1 میلی لیتر از كشت 18 ساعت
) E.col.(DH5را تلقیح می نمائیم. ارلن را برروی شبكه قرار داده و با دور rpm200 در دمای 0C37 قرار داده تا OD550nm به حدود 5/0 برسد. ارلن محتوی باكتری را بمدت نیم ساعت در یخ قرار داده و پس از آن بندت 10 دقیقه در دمای 0C4 در rpm1800 سانتریفوژ می كنیم. برروی رسوب بدست آمده 20 /میلی لیتر بافر TFB I اضافه كرده و به آرامی رسوب را در بافر حل نموده و بمدت 10 دقیقه در یخ می گذاریم. سوسپانسیون فوق را بمدت 10 دقیقه در 0C4 با دور rpm1800 سانتریفوژ كرده و به رسوب بدست‌آمده 2 میلی لیتر بافر FTB II افزوده بمدت 15 دقیقه در یخ قرار می دهیم. پس از این مدت ml100 از سوسپانسیون باكتری را در ایندرف 5/1 ریخته و آنرا در 0C70 نگهداری می نمائیم.

ترانسفورماسیون

مواد لازم:

– سلولهای Competent

– پلاسمید DNA نوتركیبی

– محیط كشت مایع نوترین برات

– پلیت حاوی محیط كشت نوترین آگار به همراه آمپی سیلین

– گرمخانه 0C37

روش كار:

1- سلولهای Comptent باكتری ) E.coli.(DH5 را از 0C70- بیرون آورده روی یخ قرار می دهیم تا باز شود.

2- مقدار ml10 از مخلوط پلاسمید نوتركیب شده در مرحله قبل، را به سلولهای Competent می افزائیم.

3- نمونه فوق را بمدت 30 دقیقه در یخ قرار میدهیم.

4- پس از زمان فوق اپندرف حاوی نمونه را بلافاصله در گرمخانه 0C37 بمدت 5 دقیقه قرار میدهیم.

5- مجدداً نمونه ها را بمدت 2 دقیقه در یخ قرار میدهیم.

6- مقدار ml800 محیط كشت نوترین برات به نمونه فوق اضافه كرده و بمدت یكساعت در 0C37 انكوبه مب كنیم.

7- پس از انكوباسیون، سوسپانسیون فوق را به پلیتهای حاوی نوترین آگار (محتوی Ng/cl60 آمپی سیلین) منتقل كرده و پلیتها را 18 ساعت در گرمخانه 0C37 قرار می دهیم.

– غربالگری

باكتریهای رشد یافته پس از ترانسفورماسیون در محییط نوترین برات آنتی بیوتیك كشت داده و پس از حدود 18 ساعت كه كدورت محیط مناسب شد، پلامیت آنها را تخلیص می كنیم. پلاسمیدهیا تخلیص شده را برروی ژل آگارز 1% بررسی می نمائیم. پلاسمیدهائی كه حاوی ژن مورد نظر باشند، حركت كنتری دارند لذا از سایر پلاسمیدهای فاقد ژن قابل شناسایی می باشند. پس از شناسایی این باكتریها با انجام PCR و هضم آنزیمی پلاسمید با آنزیمهای BamHI و xhoI مورد تایید قرار می گیرند بطوریكه در PCR قطعه مورد نظر دیده شود و در هضم آنزیمی از پلاسمید خارج شود.

برای دریافت پروژه اینجا کلیک کنید